eDNA en barcoding
Inleiding
Environmental DNA (kortweg eDNA) monitoring is een nieuwe ontwikkeling,
die steeds belangrijker wordt bij het monitoren van organismen in en buiten het
water. Met eDNA wordt op moleculair niveau vastgesteld welke soorten
er aanwezig zijn of kortgeleden aanwezig zijn geweest. Het heet ‘Environmental
DNA’ omdat het gaat om DNA dat het organisme van nature in het milieu afscheidt, bijvoorbeeld in de vorm van slijm, haren en ontlasting. Het DNA waarop de analyse zich richt is zo karakteristiek voor het organisme, dat het lijkt op een streepjescode waarmee de soort geïdentificeerd kan worden. Daarom wordt de techniek van identificatie wel DNA barcoding genoemd. DNA barcoding wordt niet alleen toegepast op eDNA, maar ook op DNA dat actief aan het organisme wordt onttrokken. Bijvoorbeeld om een macrofaunamonster te 'determineren', of een monster van kiezelwieren (Hydrochip).
Hoe werkt het?
Elk organisme laat onbewust DNA achter op de plek waar hij is geweest. Dit stelt ons in staat om een monster te nemen en te analyseren op de aanwezigheid van DNA materiaal. DNA materiaal blijft in zoet water een paar dagen tot weken goed genoeg voor analyse, in bodems blijft DNA veel langer goed genoeg voor analyse.
DNA fragmenten worden uit het monster gefilterd, geconcentreerd en verder
opgewerkt. Bij het opwerken worden de DNA sequenties van het monster gekoppeld
aan soortspecifieke sequenties (primers genoemd). Voor het opwerken worden er
bij determinatiedoeleinden doorgaans alleen gevalideerde soortspecifieke primers
gebruikt. Het valideren is in de praktijk op korte termijn mogelijk. De meest
gebruikte techniek is de klassieke PCR (Polymerase Chain Reaction), waarbij een
stukje van de doelsoort (afhankelijk van de gebruikte soortspecifieke primers) DNA
op grote schaal wordt gekopieerd, zodat er heel veel stukjes DNA met dezelfde
sequentie komen. Elke primer krijgt met zijn gekopieerde DNA een eigen plekje
op een gelplaatje. Dit gelplaatje is een ‘afdruk’ van de aan- en afwezigheid
van soorten waarna is gekeken. Deze analyse kan worden uitgebreid door
sequentie-analyse waarbij de sequenties worden vergeleken met sequenties in de
referentiedatabase. Met de kwantitatieve PCR (qPCR) wordt er aanvullend een inschatting
gemaakt van de hoeveelheid van de unieke genetische sequenties (Figuur 1).
Figuur 1. Voorbeeld van qPCR plaatje.
Een nieuwe techniek is High Throughput Sequencing, waarbij in een korte tijd een zeer veel DNA fragmenten worden verwerkt en alle fragmenten worden gebruikt voor het samenstellen van het eindplaatje. Vervolgens worden deze weer aan elkaar gekoppeld, waardoor er langere strengen van DNA sequenties ontstaan. Deze unieke sequenties worden vergeleken met een referentiedatabase waarin alle bekende DNA sequenties zitten. Op deze manier wordt inzichtelijk gemaakt van welke soorten er DNA materiaal aanwezig is in het monster.
LINK naar een Engelstalig filmpje waarin de techniek wordt gevisualiseerd
Voordelen
- Het is een niet-invasieve methode van soortendeterminatie.
- Monsternemer heeft geen specialistische of taxonomische kennis nodig.
- Moment van monstername is niet afhankelijk van het weer en tijdstip op de dag.
- Determinatie is foutloos bij een positief gevalideerde referentiedatabase.
- Goed op soort te brengen van visueel lastig te determineren soorten, of juvenielen die op andere soorten lijken.
- Eenvoudig vaststellen van de aanwezigheid van lastig te vinden of waar te nemen soorten.
Rekening houden met
- Alleen determinatie van bekende soorten in de referentiedatabase mogelijk.
- Methode vertelt niet wanneer het organisme er was, in welke levensstadium het organisme was, en of het levend of dood was.
- Mogelijkheid van monstervervuiling waarbij DNA fragmenten van het ene monster in het volgende monster terecht komen. Dit kan leiden tot vals-positieve waarnemingen.
- Het eDNA dat men op een bepaalde plek vindt kan afkomstig zijn van elders en door waterbeweging, watervogels, vis, scheepvaart, recreanten en dergelijke naar deze plek getransporteerd zijn. Dit leidt ook tot vals-positieve waarnemingen en een onterechte claim dat de methode soorten vaststelt op plaatsen waar ze met klassieke methoden nooit zijn aangetroffen.
- Risico van vervuiling door humus of humuszuren, waardoor de PCR wordt
geremd. Dit kan leiden tot vals-negatieve waarnemingen. De analyseprocedure hoort te voorzien in controles om dit soort vals-negatieve uitslagen te kunnen opsporen.
Toekomst
Het gebruik van eDNA in monitoring staat nog in de kinderschoenen, maar er wordt volop gewerkt aan de ontwikkeling van DNA barcoding voor de determinatie van diverse biologische groepen. Het doel is het kunnen determineren van alle voor de beoordeling belangrijke soorten in een monster, op basis van DNA. Dit betekent de ontwikkeling en validatie van primers in samenwerking met de klassieke taxonomie, de ontwikkeling van extractie- en opwerkingsprocedures en de doorontwikkeling van de detectie- en presentatietechnieken (volledige DNA kaarten).
Omdat de bestaande beoordelingssystemen in Nederland in het algemeen gericht zijn op abundantie, is het waarschijnlijk dat eDNA technieken voorlopig enkel aanvullend
zullen zijn op de meer traditionele methoden. Aan de andere kant, kan het nu al
van waarde zijn in de monitoring ten behoeve van de flora- en faunawet. En voor een eenvoudige beoordeling van de ecologische kwaliteit is het wellicht niet altijd nodig om precies te weten hoeveel individuen van elke soort aanwezig zijn, maar levert de soortenrijkdom alleen al een goed oordeel.
Interessante literatuur
- Bijkerk R, Patberg W, Wanink JH, Wallaart E & Warmink J (2013) De toepassing van eDna in de monitoring van waterorganismen: Hoe ver zijn we en wat moeten we nog weten? Rapport 2013-24, Stichting Toegepast Onderzoek Waterbeheer, Amersfoort.
- Herder JE, Valentini A, Bellemain E, Dejean T, van Delft JJCW, Thomsen PF & Taberlet P (2014) Environmental DNA - toepassingsmogelijkheden voor het opsporen van (invasieve) soorten. Rapport 2013-104, Stichting RAVON, Nijmegen.
- Jaspers M, Cremer H, van Ee G, de Graaf B, van der Oost R, Schuren F & van der Wijngaart T (2012) Hydrochip: De toekomst van monitoring, monitoring van de toekomst. Rapport 2012-39, Stichting Toegepast Onderzoek Waterbeheer, Amersfoort.
- STOWA (2013) Waterorganismen doeltreffender detecteren met forensische methoden. STOWA Ter Info 55: 7-11.